近日，南京農業(yè)大學棉花遺傳與種質創(chuàng)新利用團隊在國際著名學術期刊Nature Communications在線發(fā)表了題為“Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity”的研究論文。該研究鑒定到一個具有獨特串聯重復DOMAIN的新型真菌毒性蛋白VdTRP并揭示了其致病機制；解析了棉花一個細胞壁關鍵蛋白類幾丁質酶CTL1在質外體與VdTRP互作，阻止VdTRP靶向細胞膜誘導細胞死亡的抗病機制；提出基于病菌毒蛋白的寄主互作靶標關鍵基因發(fā)掘及提高作物抗病性的育種利用策略。
病原真菌是世界范圍內農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要威脅之一。2022年，聯合國糧農組織（FAO）報道全球168種作物受到數百種真菌病害的影響。黃萎病菌（Verticillium dahliae）是一種土壤傳播、半活體營養(yǎng)型的絲狀真菌。它通過根部侵染，在維管系統中定殖，導致寄主出現萎蔫癥狀，進而引發(fā)包括棉花在內的多種作物發(fā)生黃萎病，嚴重影響作物產量和品質。由于化學殺菌劑很難有效控制黃萎病危害，培育抗病品種是經濟可行的最有效途徑。眾所周知，病原菌會產生大量效應因子抑制植物免疫防御，或產生毒素直接誘導細胞死亡，促進其感染。發(fā)掘黃萎病菌關鍵效應蛋白，開展基于病菌效應蛋白的寄主互作靶標鑒定與育種利用是提高作物抗病性的重要策略之一。
為了促進寄主植物的定殖和感染，病原真菌產生大量的效應因子來調節(jié)寄主生理或逃避寄主細胞的識別。與細菌效應子通過III型分泌系統注入植物細胞不同，真菌效應因子既可在質外體也可進入植物細胞發(fā)揮毒性作用。據估計，導致作物黃萎病的大麗輪枝菌可編碼700多種分泌型效應蛋白。雖然部分效應蛋白功能已被報道，然而迄今為止，大部分效應蛋白功能仍然未知。
本研究從海島棉H7124誘導黃萎病菌強致病力菌株V991的轉錄組中鑒定到一個顯著被根組織誘導表達的新型毒素蛋白，命名為VdTRP。該蛋白結構包括一段信號肽序列、一個非典型的真菌胞外膜蛋白（CFEM）結構域、一個新型的富含脯氨酸基序(IPGGCNPAHPGSCP)組成的四肽串聯重復結構域和一段C端基序。農桿菌瞬時侵染試驗表明，VdTRP可以快速且強烈的造成煙草、棉花和擬南芥葉片細胞死亡。而敲除VdTRP的V991突變菌株則顯著降低了對棉花的致病力。研究表明，類CFEM結構域和四肽重復結構域對VdTRP的致毒性缺一不可。缺失類CFEM結構域減弱了VdTRP對煙草細胞的毒性，而缺失富含脯氨酸的四肽重復結構域導致VdTRP對煙草細胞的毒性完全喪失。氨基酸突變分析表明脯氨酸作為重要位點發(fā)揮關鍵的毒力作用，同時富含脯氨酸基序的串聯重復數目與細胞的毒性程度顯著相關。亞細胞定位顯示VdTRP定位于細胞膜，類CFEM結構域是VdTRP細胞膜定位的關鍵結構域。體外脂結合試驗證明，VdTRP的類CFEM結構域與細胞膜成分PS（磷脂酰絲氨酸）結合。進一步研究發(fā)現，純化的VdTRP蛋白可以造成體外培養(yǎng)的H9c2大鼠心肌細胞死亡。掃描離子電導顯微鏡（SICM）的表面形貌檢測與電荷同步檢測發(fā)現，VdTRP導致H9c2細胞表面穿孔，發(fā)生離子泄露。上述實驗結果表明VdTRP通過類CFEM結構域與PS結合靶向細胞膜，富含脯氨酸的四肽重復結構域發(fā)揮毒力作用使細胞膜穿孔，發(fā)生離子泄露，導致細胞死亡。
為了發(fā)掘棉花中可能抵抗VdTRP毒蛋白的靶標，研究進一步通過酵母雙雜篩庫結合多種蛋白互作手段證明VdTRP與棉花的類幾丁質酶CTL1在體內外均相互作用。酵母雙雜分段實驗、GST pull down實驗和微量熱泳動分子互作實驗證明，CTL1主要和VdTRP的C端基序互作。CTL1定位于質外體，VdTRP定位于細胞膜。然而，在煙草中共同表達CTL1和VdTRP蛋白，VdTRP細胞膜定位改變?yōu)橘|外體定位，同時VdTRP誘導細胞死亡的程度減緩。相反，在煙草中共同表達CTL1和缺失C端基序的VdTRP△C-terminal時，VdTRP△C-terminal的細胞膜定位沒有改變，且VdTRP△C-terminal誘導細胞壞死程度也未明顯減弱。這些結果表明CTL1可以在質外體與VdTRP的C端基序互作，阻止其靶向細胞膜誘導細胞死亡，進而提高植株抗病性。
研究發(fā)現，CTL1并不具有幾丁質酶活性，對大麗輪枝菌也沒有抑菌作用。轉基因實驗表明，在陸地棉中過量表達CTL1則顯著增強了植株體內糖代謝水平，增加了本底水楊酸含量并減緩了VdTRP對棉花的毒性，顯著提高了棉花對黃萎病的抗性。然而，RNAi干擾CTL1的轉基因棉花則表現為植株生長發(fā)育嚴重影響，無法完成生長周期，獲得后代。利用VIGS技術沉默CTL1，發(fā)現CTL1沉默的棉花植株出現細胞壁缺陷，莖“脆桿”和根發(fā)育減弱的表型。這些結果表明CTL1是棉花生長發(fā)育的必需基因。
綜上所述，本研究揭示了棉花生長發(fā)育關鍵因子類幾丁質酶CTL1參與黃萎病抗性的分子機制。CTL1在質外體與黃萎病菌新型毒性蛋白VdTRP相互作用，阻止VdTRP靶向細胞膜，減緩其對植株細胞膜毒性；過量表達CTL1顯著增強植株體內糖代謝水平，激發(fā)植物細胞受體蛋白/激酶類基因上調表達，觸發(fā)SA的合成并激活自身的免疫反應。研究為培育棉花抗病新品種提供了理論基礎和基因資源。
圖1. 質外體蛋白CTL1阻止新型毒蛋白VdTRP破壞細胞膜，誘導植株提高免疫，增強棉花對黃萎病抗性的工作模式圖
利用VdTRP中IPGGCNPAHPGSCP重復基序為探針，搜尋公共數據庫中不同類型真菌基因組序列，發(fā)現該基序在盤菌亞門中糞殼菌綱、座囊菌綱、錘舌菌綱和散囊菌綱等253種真菌中均保守存在，其重復數目從1-15不等。選擇三種不同來源的效應蛋白進行毒性檢測，發(fā)現均導致不同程度植株葉片萎焉。其中灰葡萄孢菌XP-001561412和VdTRP結構相似性高，含有信號肽、GPI膜錨定結構域和富含脯氨酸的重復基序，該效應蛋白致毒性強，對煙草細胞造成嚴重壞死。上述結果表明富含脯氨酸的重復基序在多種病原真菌的效應蛋白中具有相似的致毒作用，含有膜結合結構域的效應蛋白致毒性更高。
很多細菌、真菌和卵菌在侵染植物過程中都會分泌一種引發(fā)細胞凋亡的蛋白類毒素，這類毒素蛋白的發(fā)現與機理解析正越來越受到大家關注。針對前人廣泛關注的壞死和乙烯誘導型蛋白NLP1，團隊前期鑒定到過氧化物酶體定位的溶血磷脂酶GhLPL2，可抑制黃萎病菌毒素蛋白VdNLP1的毒力作用（Wang et al., 2023, The Plant Journal）。本研究鑒定了一個具有獨特串聯重復DOMAIN的黃萎病菌新型毒性蛋白，進一步解析了棉花類幾丁質酶CTL1可作為靶標阻止病菌毒蛋白侵染的抗病機制。GhLPL2和CTL1均是棉花生長發(fā)育的必需因子。這兩項研究的發(fā)現表明，植物可通過調控必需基因的表達，抵御蛋白毒素類效應因子對細胞的毒性，顯著提高黃萎病抗病性。這是不同于PTI 和ETI免疫通路的另外一種提高作物抗病性的新策略。
南京農業(yè)大學棉花遺傳與種質創(chuàng)新利用團隊博士研究生柳漢橋為論文第一作者，郭旺珍教授和生命科學學院王心宇教授為論文共同通訊作者。已畢業(yè)碩士研究生張文姝參與了VdTRP敲除與恢復突變體創(chuàng)制與鑒定工作，已畢業(yè)博士研究生何慶飛、碩士研究生熱衣拉·艾克木和許慧娟參與了轉基因棉花創(chuàng)制工作。在讀博士研究生郭展、王璐，鐘山青年研究員李維希博士和王桂林博士也參與了部分研究工作。該研究得到農業(yè)生物育種國家科技重大專項、江蘇省重點研發(fā)計劃和江蘇現代作物生產協同創(chuàng)新中心等項目資助。
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